Nachweis intestinaler Würmer mittels koproskopischer Untersuchungen

Die Infektionen sind vornehmlich in tropischen und subtropischen Gebieten weit verbreitet. Durch den Zuzug von Menschen aus Kriegsgebieten aber auch durch die zunehmende Reisetätigkeit in tropische Gebiete werden diese Erkrankungen nach Europa getragen. Die häufigsten humanmedizinischen Arten sind der Spulwurm (Ascaris lumbricoides), der Peitschenwurm (Trichuris trichiura) und die Hakenwürmer (Necator americanus und Ancylostoma duodenale).

Die parasitierenden Würmer können leichte aber auch sehr schwere Erkrankungen auslösen. Sie beeinflussen während einer Infektion sowohl das Immunsystem als auch das Verhalten des Wirts zu ihren Gunsten [1, 2]. Einige Würmer leben permanent oder temporär im Darm oder in der Leber des Wirts. In den letzten Jahren wurden einige Tests auf immunologischer, serologischer und molekularbiologischer Basis zum Nachweis einer Wurminfektion in der Hoffnung entwickelt, genauere und schnellere Befunde erstellen zu können Die sicheren Befunde sind jedoch nach wie vor der Nachweis von Eiern, von Larven oder von adulten Tieren, die im Verlauf der Infektion über den Stuhl ausgeschieden werden. Dazu stehen unterschiedliche koproskopische Untersuchungen zur Verfügung. Als Direktnachweis mikroskopiert man die Nativprobe (dünner oder dicker Stuhlausstrich). Bei geringer Parasitenanzahl im Kot werden zuvor Anreicherungsverfahren wie z.B.:

• das Sedimentationsverfahren,
• das Flotationsverfahren,
• eine Kombination aus Sedimentation und Flotation oder
• die „Merthiolate-Iodine-Formaldehyde-Concentration“-Methode (MIFC) verwendet.

Des Weiteren können bestimmte Wurmstadien direkt über das Larvenauswanderungsverfahren nach Baermann bzw. durch den Oxyurennachweis mittels Klebeband nachgewiesen werden. Post mortem kann man Wurmstadien direkt aus den Geweben isolieren. Durch immunologische Verfahren (z.B. ein ELISA) kann das Serum eines infizierten Menschen oder Tieres auf einen entsprechenden Antikörper untersucht werden.

Die human- und veterinärmedizinisch relevanten, parasitischen Würmer werden in drei Gruppen unterschieden: Die Trematoden (Saugwürmer), die Cestoden (Bandwürmer) und die Nematoden (Faden-, Rundwürmer).

Trematoden

1. Trematoden leben parasitär auf/in Fischen, Amphibien, Reptilien, Vögeln und Säugern.

2. Sie heften sich an die Wirtsoberfläche mittels eines Halteapparats.

3. In ihrem Entwicklungszyklus wechseln sie zwischen Endwirt (geschlechtliche Vermehrung) und ein bis mehreren Zwischenwirten (ungeschlechtliche Vermehrung) z.B. Fasciola hepatica (Abb. 1).

Cestoden

1. Cestoden leben im Wirtsdarm. Der Cestodenkörper lässt sich in Scolex (Kopf), Proliferationszone (Hals) und Proglottiden (= Bandwurmglieder) unterteilen.

2. Cestoden sind Zwitter. Die Proglottiden enthalten sowohl weibliche als auch männliche Geschlechtsorgane.

3. Cestoden sind darmlos. Sie nehmen die Nährstoffe über das Tegument auf.

Nematoden

1. Nematoden können freilebend und/oder parasitisch sein und sind getrenntgeschlechtlich.

2. Sie durchlaufen meist 4 Jugendstadien. Das Larvenwachstum ist mit Häutungen verbunden.

3. Die Entwicklung der Wirbeltierparasiten ist mit und ohne Zwischenwirt möglich.

Da die Stuhlzusammensetzung stark von der Ernährung abhängig ist, überleben in dem Gemisch aus Nahrungsüberresten, Verdauungssekreten, Darmflora und Darmzellen nur solche Wurmstadien, die eine resistente Umhüllung haben. Daher haben die Wurmeier oft eine derbe äußere Hülle oder mehrere Hüllschichten (Abb. 3). Insbesondere die Verdauungssekrete und Bakterien aus der Darmflora sorgen dafür, dass nach einem frisch abgesetzten Stuhl viele Zersetzungsprozesse ablaufen. Daher ist es wichtig, eine Stuhlprobe möglichst zeitnah zu untersuchen, um falsch negative Ergebnisse zu meiden.

Zur Übersicht kann man das native Material mikroskopisch untersuchen. Bei starker Parasitierung wird man schnell fündig, aber eine schwache Parasitierung entgeht dem Betrachter. Finden sich Wurmeier in der Kotprobe, wird nach folgendem Schema diagnostiziert:

Größe – Form – Schale – Inhalt.

Eier können sehr klein (bis 50 μm, z.B. Taenia, Abb. 2a) , mittelgroß (50–120 μm, z.B. Strongyliden, Ascaris, Trichuris, Abb. 2b + 2c), oder groß (120–200 μm, z.B. Fasciola hepatica, Abb. 2d) sein.

Die Eiform der Würmer variiert von rund, eiförmig/oval über längsoval/elliptisch bis zitronenförmig. Die Eischalen sind dick oder dünn, ununterbrochen oder unterbrochen, mit oder ohne Deckel, glatt oder rauh, farblos, grau oder farbig.

Der Ei-Inhalt kann aus Eizelle mit Dotterzellen bestehen, aber auch eine Embryophore oder Furchungskugeln enthalten, und bei einigen sind bereits entwickelte Larven ohne oder mit Haken zu sehen (Abb. 3). Ist in einem Nativausstrich nichts zu finden, ermöglichen verschiedene koproskopische Anreicherungsverfahren den Nachweis einer Infektion und gelegentlich auch eine genaue Bestimmung des parasitären Wurms [4, 5, 6].

Mit dem Sedimentationsverfahren reichert man neben Trematodeneiern (z.B. Fasciola spp.) auch Oozysten von parasitischen Protozoen (z.B. Eimerien) an. Dabei sedimentieren Parasitenstadien mit hohem spezifischem Gewicht in Wasser schneller als Kotpartikel.

1. Kotprobe (Mensch, Rind, Pferd ca. 10 g, kleine Säuger ca. 3–10 g) mit etwas Wasser in einem Becher zu einer homogenen Suspension verrühren.

2. Suspension durch ein Sieb (250–300 µm) in ein 250 ml Becherglas gießen, Siebrückstand mit Wasser auswaschen bis Becher ¾ gefüllt ist.

3. Genau 3 min zur Sedimentation stehen lassen, danach Überstand abgießen.

4. Becher erneut mit Wasser auffüllen und wieder 3 min sedimentieren lassen.

5. Schritt 4 bis zu 2-mal wiederholen, bis die Flüssigkeit wässrig – klar ist.

6. Flüssigkeit dekantieren zum Sediment 1 Tropfen 1 % Methylenblau-Lösung zufügen. Das Sediment in eine Petrischale überführen und mikroskopisch durchmustern.

Dieses Verfahren dient der Anreicherung von Nematodeneiern und Oozysten parasitischer Protozoen. Die Parasitenstadien mit geringem spezifischen Gewicht flottieren in einer Lösung mit höherem spezifischen Gewicht. Flotationslösungen können sein: gesättigte NaCl-Lösung, NaNO₃-Lösung, ZnCl₂-Lösung, ZnSO₄-Lösung oder Kristallzuckerlösung (alle je mit einer Dichte von 1,2 bis 1,3).

1. Kotprobe (3–5 g) mit etwas Wasser in einem Becher zu einer homogenen Suspension verrühren. Anschließend ca. 10-faches Volumen Flotationslösung zufügen und mischen.

2. 15 ml Suspension durch Teesieb (500–800 µm) in ein Zentrifugenröhrchen gießen. Zwei Zentrifugenröhrchen parallel anfertigen und beide 3 min bei ca. 2.000 U/min zentrifugieren.

3. Von der Oberfläche der Suspension mit Drahtöse 2–3 Tropfen abnehmen (Öse nicht eintauchen!), diese auf Objektträger verbringen und Deckglas auflegen.

5. Probe mikroskopisch untersuchen.

Es gibt alternativ auch die Möglichkeit, die gesamte Suspension in ein 50 ml Becherglas zu geben und mit Flotationslösung bis zum Rand aufzufüllen. Ein quer gelegter Objektträger nimmt in der nachfolgenden 30-minütigen Flotationszeit die Parasitenstadien von der Oberfläche auf. Der Objektträger kann anschließend unter dem Mikroskop untersucht werden.

Eine Quantifizierung der Parasitenzahl für menschlichen und tierischen Kot ist möglich, indem der Kot gewogen und nach einer Flotation in einer Zählkammer (McMaster-Zählkammer) die Anzahl der Parasiten unter dem Mikroskop bestimmt werden. Die Parasitenanzahl wird auf die Kotmenge von 1 g berechnet. Im Ergebnis erhält man die Eizahl pro g Kot (EpG).

Für das Sedimentations- und das Flotationsverfahren gibt es kommerziell erhältliche Kits, die eine rationelle und standardisierte Aufarbeitung mehrerer Proben erlaubt (z.B. ParasiTrap® der Fa. Biosepar, ParaTest, Parasep® usw.). Um größere Kotmengen untersuchen zu können, kann man das Sedimentations- und das Flotationsverfahren in Kombination anwenden.

Bei dieser Methode wandern Nematodenlarven aus dem Kot ins Wasser aus und sedimentieren aufgrund ihrer Schwimmunfähigkeit. Dadurch werden lebende Lungenwurm- und Strongylidenlarven angereichert.

1. Kotprobe (Mensch, Rind, Pferd 10–30 g, kleine Tiere 5–10 g) in Gaze einhüllen, flach drücken und auf einem dünnmaschigen Sieb in einen mit Wasser gefüllten „Baermann-Trichter“ (Abb. 8) hängen. Der Kot sollte bis zur Hälfte vom Wasser bedeckt sein.

2. Den Trichter 12–24 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen.

3. Danach Schlauchklemme vorsichtig öffnen und die ersten 2–3 Tropfen auf einem Objektträger auffangen und Deckglas auflegen.

4. Gesamtes Deckglas im Mikroskop durchmustern.

Mittels eines durchsichtigen Klebestreifens, der im Analbereich des infizierten Wirts angebracht und wieder abgezogen wird, kann man unter dem Lichtmikroskop die lebenden Oxyuren-Larven bzw. die Eier nachweisen (Abb. 4).

Das MIFC-Verfahren ist ein universelles Verfahren, das sämtliche Wurmeier, Wurmlarven sowie alle Protozoenstadien erfasst. Nachteilig ist die Arbeit mit Äther, welcher hochentzündlich und gesundheitsschädlich ist. Daher wurde das MIFC-Verfahren mehrfach modifiziert, um den Einfluss verschiedener Lösungsmittel, die den Äther ganz oder teilweise substituieren, auf die Ausbeute und Darstellbarkeit der Parasitenstadien zu vergleichen [7]. Im Ergebnis zeigen die untersuchten Lösungsmittel Diäthyläther, Äthylacetat, Diäthyläther-Äthylacetat-Gemisch einige Unterschiede auf, wobei das Äthylacetat in der Untersuchung von Albrecht und Schubert die besten Ergebnisse bei der Erfassung der Gesamtausbeute von Wurmeiern aufwies [7].

In der Vergangenheit wurde dieses Verfahren verwendet, um Wurmeier, insbesondere vom Pärchenegel (Schistosoma), nachzuweisen. Es hat sich aber herausgestellt, dass die Eier des Hakenwurms nicht erfasst werden, weil sie im Verlauf der Prozedur zerstört werden. Überdies ist die Reproduzierbarkeit mäßig und bedingt durch die Methode ergibt sich eine erhöhte Ansteckungsgefährdung für den Untersucher [8].

Überdies gibt es noch einige Methoden, die den Nachweis von Würmern Post mortem erlauben wie z.B. die Verdauungsmethode zum Nachweis von Trichinen aus der Muskulatur des Wirts (z.B. Wildschwein), einen Darmabstrich bzw. die Untersuchung der Leber zum Nachweis von Echinococcus spp. Da bei allen Methoden mit potenziell infektiösem Material gearbeitet wird, sind im Labor stets die notwendigen Sicherheitsmaßnahmen zu treffen.

Serologische Antikörpernachweise, wie beispielsweise eine ELISA-Untersuchung, sind vorsichtig zu interpretieren, da es zu Kreuzreaktionen mit Antikörpern kommen kann, die aus anderen Wurminfektionen herrühren. Oft ist hier auch keine artspezifische Zuordnung möglich, sondern nur eine Unterscheidung zwischen Trematoden, Nematoden oder Cestoden. Nachteilig ist auch, dass der Antikörpernachweis keine Unterscheidung zwischen aktiver und ausgeheilter Infektion zulässt.

Literatur

1. Morales-Montor J, Picazo O, Besedovsky H, Hernández-Bello R, López-Grego L, Becerril-Villanueva E, Moreno J, Pavón L, Nava-Castro K, Camacho-Arroyo I. Helminth infection alters mood and short-term memory as well as levels of neurotransmitters and cytokines in the mouse hippocampus. Neuroimmunomodulation 2014, 21: 195–205.

2. Maizels RM, Balic A, Gomez-Escobar N, Nair M, Taylor MD, Allen JE. Helminth parasites – master of regulation. Immunol Rev. 2004, 201:89–116.

3. Harada Y, Mori O. A new method for culturing hookworm. Yonago Acta Med. 1955, 1:177–179.

4. Mehlhorn H. Die Parasiten der Tiere 7. Aufl. Springer Spektrum, 2012.

5. Neumeister B, Geiss HK, Braun RW, Kimmig P. Mikrobiologische Diagnostik. 2. Aufl. Thieme Verlag, 2009.

6. Eckert J, Friedhoff KT, Zahner H, Deplazes P. Lehrbuch der Parasitologie für die Tiermedizin. Enke Verlag, 2008.

7. Albrecht E, Schubert St. Die MIFC-Methode in verschiedenen Modifikationen für das parasitologische Routinelabor. Mitt. Österr. Ges. Tropenmed. Parasitol. 1991, 13: 183–190.

8. Kongs A, Marks G, Verlé P, Van der Stuyft P. The unreliability of the Kato Katz method for evaluating S. mansoni infection. Trop Med Intl Health, 2001, 6: 163–69.

9. Ash LR. Bench Aids for the diagnosis of intestinal parasites. WHO Library cataloguing in publication data, 2000.

10. WHO: Soil-transmitted helminth infection, fact sheet 366, 2015.

Entnommen aus MTA Dialog 11/2015