Pilzinfektionen bei Mukoviszidose

Die Kultivierung gelingt auf dem üblicherweise verwendeten Sabouraud-Glukose-Agar oder Malz-Extrakt-Agar sowie auf Selektivmedien für Sprosspilze und bestimmte Schimmelpilze.

Je nach Pilzspezies kann die Bebrütungszeit zwischen 24 Stunden und mehreren Tagen betragen.

Für den mikroskopischen Pilznachweis aus Patientenproben wird vorwiegend die Calcofluorwhite-Färbung durchgeführt. Calcofluorwhite ist ein chemischer Aufheller, der sich an Zellulose und Chitin bindet, die Bestandteile der Pilzzellen sind. Angeregt durch kurzwelliges UV-Licht leuchten die Pilzzellen bläulich-weiß. Die Färbung ist sensitiver als die Gramfärbung. Bei intensiver Begleitflora sind die Pilzelemente leichter erkennbar.

Der Respirationstrakt von CF-Patienten ist bis zu 75% mit Candida-Spezies besiedelt. Dabei handelt es sich zu 80 % um C. albicans, gefolgt von C. dubliniensis als 2. häufigste Candida-Spezies, weitaus seltener C. glabrata, C. tropicalis, C. kefyr u.a. Werden Candida-Spezies im Respirationstrakt nachgewiesen, handelt es sich fast immer nur um eine Kolonisation. Katheter assoziierte Candidämien werden sehr selten diagnostiziert.

Diagnostik

Relativ problemlos sind Candida-Spezies auf Blut-, Kochblutagar und einer selektiven, chromogenen Kulturplatte anzüchtbar.

Direktnachweis

Mikroskopie

Der mikroskopische Nachweis von Candida spp. im Direktpräparat von Untersuchungsproben hat zwar nur eine geringe Sensitivität, kann aber im positiven Fall noch am Tag der Materialentnahme einen Hinweis auf eine Candidose geben.

Antigennachweis

(1,3)-ß-D-Glucan

Der (1,3)-D-Glucan-Antigentest ermöglicht aus Serum, bronchoalveolärer Lavage und Liquor eine frühe und schnelle Diagnose einer Candidämie. Das (1,3)-ß-D-Glucan ist ein Polysaccharid in der Zellwand verschiedener Pilzarten wie Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Trichosporon und Pneumocystis jiroveci. Die Messung der Konzentration von (1,3)-ß-D-Glucan im Bereich von wenigen Pikogramm gelingt u.a. mit Hilfe eines Gerinnungsenzyms (Faktor G) der japanischen Hufeisenkrabbe Tachypleus tridentatus. Eine Unterscheidung zwischen den verschiedenen Erregerarten kann nicht getroffen werden.

Differenzialdiagnostisch kann bei einem positiven Ergebnis auch eine Aspergillose, Pneumocystose, Cryptococcus- und Trichosporon-Infektionen in Frage kommen.

Molekularer Nachweis

Zum schnellen Nachweis von Candida spp. direkt aus klinischen Untersuchungsproben sind unterschiedliche PCR-Verfahren kommerziell erhältlich. Mit der Multiplex-Real-Time-PCR (z. B. LightCycler SeptiFast) gelingt innerhalb von 6 Stunden der Nachweis von C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis , C. krusei u.a. sowie A. fumigatus.

Kulturelle Verfahren

Blutkultur

Während die Blutkultur bei einer Aspergillose in der Regel negativ bleibt, wird die Blutkultur bei einer Candidämie in 50 % bis 60 % der Infektionen positiv. Die Entnahme von mindestens 3 Blutkulturpaaren (aerob/anaerob) am Tag ist sinnvoll. Automatisierte Blutkultursysteme wie BacT/ALERT 3D (bioMérieux) oder BACTEC 9240 (Becton Dickinson) bieten den Vorteil, dass die Blutkulturflaschen kontinuierlich auf Keimwachstum überprüft werden. Zudem werden Medien eingesetzt, die speziell das Pilzwachstum fördern.

Ein positives Blutkulturergebnis ist nicht zwingend mit einer Candidämie gleichzusetzen. Es kann sich auch um eine nicht pathogene Kolonisation handeln. Wiederholte positive Kulturen bei entsprechendem klinischen Verdacht erlauben eine verlässliche Diagnose.

Eine schnelle Identifizierung der Candida-Erreger aus einer positiven Blutkultur kann molekularbiologisch erfolgen. Zusätzlich kann eine Kultur zur Anzüchtung und anschließender Sensitivitätsbestimmung angelegt werden.

Koloniemorphologie von Candida-Spezies

Blut- und Sabouraud-Glukose-Agar

Auf Blutagar- und Sabouraud-Glukose-Agar-Platten bildet C. albicans mittelgroße, weiße, leicht erhabene Kolonien mit glattem Rand matter Oberfläche und pastöser Konsistenz (Abb. 1).

Chromogene Kulturplatten

Die selektiven chromogenen Kulturplatten z. B. BBl CHROMagar Candida (Becton Dickensen), Candida ID2-Agar (bioMérieux), Brilliance Candida-Agar Oxoid), deren Wirkungsweisen auf bestimmte Substrate und Indikatorreaktionen beruhen, ermöglichen nach 2- bis 3-tägiger Bebrütung im positiven Fall anhand der Koloniemorphologie und einem Farbumschlag eine schnelle Identifizierung von Candida-Spezies.

Koloniemorphologie auf Brilliance Candida-Agar:

C. albican wächst mit grünen Kolonien (Abb. 2), C. tropicalis bildet dunkelblaue Kolonien (Abb. 3), C. krusei rosa-violette Kolonien (Abb. 4) und C. glabrata kleine beige Kolonien aus. Mischkultur von Candida-Spezies (Abb. 5).

Reis-Tween-Agar

Der Reis-Tween-Agar enthält als einzige Nährstoffgrundlage Reisextrakt. Die Nährstoffarmut bildet zusammen mit Sauerstoffmangel ein kulturelles Mangelmilieu, wodurch bei Raumtemperatur die Ausbildung von Pseudomyzel und Chlamydosporen angeregt wird. Nach 2- bis 4-tägiger Bebrütung lassen sich unter dem Mikroskop auf der Reis-Tween-Agarplatte alle Stadien der Sprossung von Blastosporen, Pseudomyzel und der Chlamydosporenbildung verfolgen. Die am Pseudomyzel sitzenden Chlamydosporen sind runde, mit einer stark lichtbrechenden, doppelt konturierten Zellwand versehene Dauersporen, die zur Erhaltung der Art dienen (Abb. 6). Chlamydosporen werden von C. albicans und C. dubliniensis ausgebildet. C. dubliniensis bildet auch auf Guizotia-abyssinia-Kreatin-Agar (Staib- Agar) Chlamydosporen während C. albicans auf diesem Agar keine Chlamydosporen ausbildet.

Abb. 1: Koloniemorphologie von C. albicans auf Sabouraud-Glukose-Agar

Abb. 2: Reinkultur von C. albicans auf Brilliance Candida-Agar

Abb. 3: Reinkultur von C. tropicalis auf Brilliance Candida-Agar

Abb. 4: Reinkultur von  C. krusei auf Brilliance Candida-Agar

Abb. 5: Mischkultur von C. albicans  (grüne Kolonien), C. tropicalis (dunkelblaue Kolonien),  C. krusei (rosa-violette Kolonien), C. glabrata (kleine beige Kolonien) auf Brilliance-Candida-Agar.

Abb. 6: Mikromorphologie von  C. albicans mit Blastosporen und Pseudohyphen mit endständigen, doppelwandigen Chlamydosporen auf Reis-Tween-Agar

Biochemische Identifizierung

Liegt C. albicans nicht vor, kann bei Bedarf zur weiteren Identifizierung der Candida spp. eine biochemische Differenzierung durchgeführt werden. Kommerzielle nicht automatisierte Testkits oder automatisierte Systeme stehen zur Verfügung. Schneller geht es mit MALDI-TOF MS.

Empfindlichkeitstestung

Methoden

Mikrodilutionstest

Durchgesetzt hat sich der Mikrodilutionstest zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK). Die Beschickung der Mikrotiterplatte ist zeitaufwendig. Die visuelle Ablesung der Ergebnisse erfordert viel Erfahrung.

MICRONAUT-AM

Der MICRONAUT-AM Test ist ebenfalls ein Mikrodilutionstest. Die Mikrotiterplatten können manuell oder automatisiert mit dem MICRONAUT Sprint beimpft werden. Die photometrisch ermittelten Messwerte werden mit Hilfe der MICRONAUT Software ausgewertet, interpretiert und auf Plausibilität überprüft.

Automatisierte Bestimmung

Mit dem VITEK 2 compact steht u.a. eine vollautomatisierte Methode zur Empfindlichkeitsprüfung von Sprosspilzen zur Verfügung. Zusätzlich zu Fluconazol, Voriconazol, Amphotericin B und Flucytosin werden auch die zur Gruppe der Echinocandine gehörenden Antimykotika Caspofungin, Micafungin und Posaconazol getestet. Die Ergebnisse liegen am gleichen Tag vor.

Schimmelpilze

Neben Sprosspilzen werden auch Schimmelpilze als Krankheitserreger aus respiratorischen Materialproben bei Mukoviszidose-Patienten isoliert, vorwiegend Aspergillus fumigatus, seltener Scedosporium apiospermum, Exophiala dermatitidis und Aspergillus terreus. Vorübergehend kann der Respirationstrakt mit folgenden bisher als apathogen eingestuften Schimmelpilzen wie Aspergillus flavus, Aspergillus nidulans, Penicillium spp., Cladosporium spp. und Alternaria spp. besiedelt sein.

Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus (Abb. 8) ist der häufigste Schimmelpilz, der bei CF-Patienten nachgewiesen wird. Je älter der Patient ist, umso häufiger wird A. fumigatus isoliert. 30 % der CF-Patienten sind mit A. fumigatus kolonisiert. Der Nachweis von A. fumigatus wird in vier Klassen eingestuft:

■ Klasse 1: keine Aspergillus Probleme: kein Galaktomannan- Antigen, keine Antikörper nachweisbar.

■ Klasse 2: serologische ABPA: Galaktomannan-Antigen und Antikörper nachweisbar.

■ Klasse 3: Aspergillus Sensibilisierung ohne ABPA: kein Galaktomannan-Antigen nachweisbar, Antikörper vorhanden.

■ Klasse 4: Aspergillus Bronchitis: Galaktomannan-Antigen nachweisbar, keine Antikörper vorhanden.

Allergische bronchopulmonale Aspergillose

Bis zu 10 % der CF-Patienten sind betroffen, vorwiegend ab dem 2. Lebensjahrzehnt . Die allergische bronchopulmonale Aspergillose (ABPA) entwickelt sich aufgrund permanenter Sensibilisierung des Organismus durch Aspergillus fumigatus spezifische Allergene, die aus der Umgebung stammen. Das Krankheitsbild ist gekennzeichnet durch Symptome wie Atemnot , pulmonale Infiltrate, Bronchiektasen und Fibrose. Die Diagnose einer ABPA ist schwierig, da viele diagnostische Kriterien mit den allgemeinen Symptomen der Mukoviszidose übereinstimmen. In einer Konsensuskonferenz hat sich deshalb die Cystic Fibrosis-Foundation auf folgende Kriterien geeinigt:

■ Akute oder subakute klinische Verschlechterung (Husten, Atemnot, vermehrte Sputumproduktion, verringerte Lungenfunktion).

■ Gesamt IgE muss >1.000 IU/ml betragen.

■ Positiver Prick-Test (>3 mm) oder spezifisches IgE.

■ Nachweis spezifischer IgE-Antikörper gegen A. fumigatus.

■ Präzipitierende Antikörper gegen A. fumigatus oder Nachweis spezifischer IgG-Antikörper gegen A. fumigatus.

■ Erkennbare Veränderung auf der Röntgenaufnahme oder im CT der Lunge, die sich nicht durch Antibiotika oder Standardtherapie reduzieren lassen.

Zur Therapie wird Kortison zur Entzündungshemmung und Itraconazol als Mittel der 1. Wahl zur Therapie eingesetzt. Wird eine Aspergillus Therapie angestrebt, muss vorher eine Resistenzbestimmung durchgeführt werden.

Scedosporium apiospermum

Scedosporium apiospermum (Abb. 10) ist der zweithäufigste Schimmelpilz, der bei CF-Patienten isoliert wird. Die Prävalenz in Deutschland wird mit 5 % angegeben. S. apiospermum ist weltweit verbreitet und kommt vorwiegend im Erdreich und in Gewässern vor. Infektionen erfolgen durch Inhalation der Sporen von S. apiospermum, seltener nach Aspiration von kontaminiertem Wasser (beinahe Ertrinkungsunfälle). S. apiospermum kann Myzetome, Keratitis, Sinusitis und Infektionen der Lunge hervorrufen. Die Symptome der respiratorischen Infektion ähnelt denen der A. fumigatus-Infektion.

Infektionen mit S. prolificans werden in Spanien, in den USA und in Australien beobachtet.

Der Nachweis von S. apiospermum ist entscheidend davon abhängig, welche Kulturmedien zur Anzüchtung beimpft werden. Wird zusätzlich zum Sabouraud- und/oder Mycosel-Agar der selektive SCSel-Agar (muss selber hergestellt werden) beimpft, erhöht sich der Nachweis von S. apiospermum um 50 %. Die Kulturen müssen bis zu 21 Tagen bebrütet werden. In Anbetracht der langen Inkubationszeit kann ein molekularbiologischer Erregernachweis indiziert sein. Transplantierte Patienten, die mit Scedosporium spp. besiedelt sind, sterben bis zu 50 % innerhalb des ersten Jahres nach Transplantation. S. apiospermum weist eine geringe Empfindlichkeit gegenüber Antimykotika auf. Bei klinischer Indikation zur Therapie sollte eine Empfindlichkeitstestung durchgeführt werden.

Exophiala dermatitidis

Exophiala dermatitidis auch unter der Bezeichnung „schwarze Hefe“ bekannt, ist ein thermophiler Pilz, der überall dort anzutreffen ist, wo ein feuchtwarmes Milieu herrscht wie z. B. in Saunen, Dampfbädern, Luftbefeuchtern, Bewässerungsanlagen und unter anderem auch in Spülmaschinen. In einer Veröffentlichung wurde berichtet, dass bei Untersuchungen von Spülmaschinen bei jeder zweiten Schimmelpilze nachgewiesen wurden und dabei handelte es sich in jedem 2. Fall um E. dermatitidis. Die eigentlichen Verbreitungsgebiete sind tropische Regionen und im Regenwald.

E. dermatitidis ist ein potenzieller pathogener Pilz, der lokale oberflächliche Hautinfektionen im Gesicht und am Hals verursachen kann und bei Immunsuppremierten zu systemischen Infektionen führt. Akute schwere Infektionen des ZNS mit hoher Sterblichkeitsrate werden aus dem ostasiatischen Raum berichtet. CF-Patienten sind zu 5 bis 10 % mit E. dermatitidis kolonisiert.

Während E. dermatitidis auf Sabouraud-Glukose-Agar kein optimales Wachstum zeigt, zeigt er auf Erythritol-Chloramphenicol-Agar gutes Wachstum. Die Kulturen müssen bei 40°–42°C für 14 Tage und länger bebrütet werden. Junge Kolonien von E. dermatitidis zeigen zunächst glatte hefeartige schwärzliche (Melaninbildung, Virulenzfaktor) Kolonien (Abb. 11) bei längerer Bebrütung zeigen sich pigmentierte Lufthyphen mit endständig angeordneten runden bis ovalen Konidien (Abb. 12).

Abb. 7: Mikromorphologie von  C. glabrata bildet keine Pseudohyphen auf Reis-Tween-Agar aus.

Abb. 8: A. fumigatus  auf Sabouraud-Glukose-Agar

Abb. 9: Konidiophor von A. fumigatus,  Trichrom-Färbung

Abb.  10:  S. apiospermum auf  Sabouraud-Glukose-Agar

Abb. 11: 6 verschiedene E. dermatitidis  Isolate auf Sabouraud-Glukose-Agar

Abb. 12: Mikroskopische Morphologie von E. dermatitidis

Rasamsonia argillacea

Rasamsonia argillacea ist ein weiterer potenziell pathogener Schimmelpilz, der zum ersten Mal 2006 beschrieben wurde. In den letzten Jahren wird er vermehrt bei der Cystischen Fibrose und anderen Erkrankungen nachgewiesen. Rasamsonia spp., Paecilomyces spp. sowie Penicillium spp., die u. a. auch im Sputum von CF-Patienten vorkommen können, sind anhand der mikroskopischen Morphologie der Hyphen, Konidiophoren und der Anordnung der Sporen kaum zu unterscheiden. Eine sichere Identifizierung wäre nur durch Sequenzierung möglich. Zum direkten Nachweis von R . argillaceae aus Sputum ist eine sensitive und spezifische Real-Time PCR kommerziell erhältlich.

Diagnostik

Sputumproben müssen aufgrund der hohen Viskosität und inhomogener Verteilung der Pilzerreger mit Sputasol 1:1 homogenisiert und verflüssigt werden.

Antigennachweis

(1,3) -ß-D-Glucan-Antigennachweis

Galaktomannan-Antigennachweis

Der Aspergillus-Galactomannan-Test, der das Zellwandmolekül Galactomannan detektiert, das relativ spezifisch für Aspergillus spp. ist, hat sich als früher Marker einer Aspergillus-Infektion etabliert. Die gebräuchlichsten kommerziell erhältlichen Tests sind der Pastorex Aspergillus Latex-Agglutinationstest (Bio-Rad) und der Platelia Aspergillus Sandwich-ELISA (Bio-Rad). Beide Teste arbeiten mit monoklonalen Rattenantikörpern, die spezifisch gegen Galaktomannan gerichtet sind. Der Sandwich-ELISA ist nicht nur sensibler als der Latex-Agglutinationstest, sondern wird häufig in einem früheren Stadium der Erkrankung positiv. Galaktomannan-Konzentrationen von 1-5 ng/ml können noch nachgewiesen werden.

Kreuzreaktionen mit Zellwandbestandteilen von anderen Schimmelpilzen wie Penicillium u a. können auftreten. Mit falsch positiven Ergebnissen ist bei einer Antibiotikatherapie aufgrund produktionsbedingter Reste von Pilzbestandteilen im Antibiotikum zu rechnen.

Kulturelle Verfahren

Sabouraud- und Malzagar, wenn mit einer Begleitflora (P. aeruginosa) zu rechnen ist mit Antibiotika-Zusatz, sind bewährte Kulturmedien zur Anzüchtung von Schimmelpilzen. Ggf. Einsatz von Selektivmedien wie SceSel-Agar und Erythritol-Chloramphenicol-Agar (ECA). Die Kulturen werden bis zu 10 Tagen, SceSeL-Agar 21 Tage und länger bei 30°C und 35–37°C bebrütet. Bei Verdacht auf A. fumigatus zusätzlich bei 50°C.

Identifizierung

Makroskopische Koloniemorphologie:

Zur makroskopischen Beurteilung der Koloniemorphologie werden folgende Merkmale herangezogen:

■ Wachstumsdauer,

■ Beschaffenheit der Kolonieoberfläche,

■ Pigmentbildung (Einfärbung) der Kolonieoberfläche/Unterseite der Kulturplatte.

Anhand der Koloniemorphologie kann eine erste Verdachtsdiagnose gestellt werden. Zur Bestimmung der Pilz-Spezies ist eine mikroskopische Beurteilung erforderlich.

Mikroskopische Beurteilung:

Die mikromorphologische Identifizierung erfolgt anhand des artcharakteristischen Aufbaus der Fruktifikationsorgane. Voraussetzung für eine Identifizierung ist ein voll ausgebildetes Luftmyzel. Um diesen Zeitpunkt zu erfassen, sollte ab sichtbarer Koloniebildung täglich ein Tesafilmabrisspräparat von der Kolonieoberfläche angefertigt werden. In der Abbildung 9 ist ein Konidiophor von A. fumigatus zu sehen.

Schneller ist eine Identifizierung mit MALDI TOF MS.

Die Autorin:
Ursula Brett, MTA
Uhlenkruggarten 4
45133 Essen
E-Mail: u.brett@arcor.de

Entnommen aus MTA Dialog 12/2015